特發(fā)性肺纖維化（IPF）描述了一種慢性和進行性肺部疾病，會造成肺功能喪失和纖維化重塑。在損傷肺泡修復(fù)過程中，肺泡II 型上皮細胞（AT2細胞）是重要的干細胞群體，能夠在損傷后自我擴增并分化為肺泡 I 型上皮細胞（AT1細胞）。考慮到AT2細胞在治療IPF進展中的關(guān)鍵作用，維持AT2干細胞特性以促進肺泡修復(fù)被認為是一種有前途的治療策略。

與健康肺相比，IPF肺的AT2細胞中 CYB5R3 mRNA 和蛋白水平的下調(diào)不僅與 NAD+/NADH 失衡相關(guān)的線粒體穩(wěn)態(tài)有關(guān)，還參與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1） 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常激活；在肺纖維化的病理學(xué)中，持續(xù)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP4）的信號會促進AT2異常增殖和成纖維細胞基質(zhì)合成，導(dǎo)致瘢痕形成和肺泡塌陷。為此，CYB5R3和BMP4的高表達都可能有助于恢復(fù)肺上皮細胞的纖維化，可作為候選mRNA治療藥物。

基于mRNA的治療已經(jīng)成為各種臨床領(lǐng)域中一種安全且有效的治療形式，例如病毒疫苗、蛋白質(zhì)替代療法、基因組編輯和癌癥免疫療法。然而，mRNA介導(dǎo)的治療高度依賴于優(yōu)化的遞送載體和合適的給藥途徑。霧化吸入作為一種簡單易行的方法，由于其獨特的優(yōu)點，被認為是臨床上治療呼吸系統(tǒng)疾病最有前途的方法之一。與此同時，隨著治療技術(shù)的快速發(fā)展，基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)已廣泛用于肺部疾病治療。靶向呼吸上皮細胞的霧化LNP將是IPF治療中基于mRNA的蛋白質(zhì)替代療法的理想選擇，可以在肺部實現(xiàn)累積并滯留。但霧化給藥存在強剪切力問題，且肺部具有粘膜層、吞噬細胞等特異性的屏障，這些原因在一定程度上阻礙了吸入mRNA療法的功效。

研究表明，使用肺表面成分作為納米顆粒表面涂層可通過界面遞送改善在粘液屏障上的擴散，可以更好地靶向深層肺組織和上皮細胞攝取以進行藥物遞送。受此啟發(fā)，研究人員將肺表面活性劑中豐富的磷脂二棕櫚酰磷脂酰膽堿 （DPPC） 摻入LNP成分中，以制備具有粘液滲透性的肺表面活性劑仿生 LNP。

基于以上背景及發(fā)現(xiàn)，山東大學(xué)姜新義教授研究團隊在 《Science Advances》上發(fā)表了題為“Realveolarization with inhalable mucus-penetrating lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary fibrosis in mice”的創(chuàng)新性研究成果。該團隊開發(fā)了一類基于 γ-氨基丁 （GABA） 的可電離脂質(zhì)并優(yōu)化LNP配方，通過體外篩選實現(xiàn)高效 mRNA 遞送。優(yōu)化的 LNP同時封裝遞送了BMP4和CYB5R3 mRNA，以調(diào)節(jié)AT2干細胞耗竭并進行IPF治療（圖 1）。結(jié)果表明，mRNA-LNP系統(tǒng)在肺上皮細胞中顯示出高蛋白表達，擺脫了肺泡塌陷問題并延長了纖維化小鼠的存活時間，提供了一種可行的臨床對抗IPF的策略。

圖1 mRNA-LNP 吸入遞送至 AT2 細胞以逆轉(zhuǎn)上皮干細胞耗竭治療IPF

? mRNA 遞送的吸入 LNP 的篩選和優(yōu)化

通過使用簡單的取代和酯化反應(yīng)將烷基尾和胺基頭與γ-氨基連接鍵反應(yīng)，生成可電離脂質(zhì)庫（圖2B）。為了確定最佳的候選處方，按照正交設(shè)計表制備LNP（圖2C）和表 S1）。涉及到的輔助脂質(zhì)材料：DOPE、DPPC、DSPE-PEG2000和膽固醇。主要包載EGFP mRNA或FLuc mRNA用于后續(xù)體外篩選和體內(nèi)吸入篩選最佳處方（圖2D）。

圖2  吸入mRNA LNPs處方篩選組合方案及制備方法

多種處方的相容性和最顯著的轉(zhuǎn)染效率（圖3A）。為了獲得 GAE14 的最佳配方，表征了五種主要候選配方 （GAE14A、GAE14E、GAE14L、GAE14M 和 GAE14N） 的大小、表面電荷、mRNA包封率和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，五種制劑霧化前后的 zeta 電位沒有顯著變化，但粒徑和PDI有不同幅度增加（圖3B和C），包封率也有所下降。其中 GAE14M 和 GAE14N 似乎更好地將 mRNA 保留在霧化 LNP 中（圖3D），但霧化后GAE14N 在上皮細胞中實現(xiàn)了最佳的轉(zhuǎn)染效率（圖3E）。考慮到轉(zhuǎn)染效率、理化性質(zhì)的穩(wěn)定性等因素，最后選擇了GAE14N處方來制備 LNPs。為了改善細胞對LNP的攝取，對LNP進行SP-A（肺表面活性蛋白A）抗體修飾（用 DSPE-PEG2000-NHS取代PEG 脂質(zhì)，以相同的方法制備SLNPs），共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和流式細胞術(shù)測定顯示MLE12 細胞中SP-A 抗體修飾的SLNPs細胞攝取率更高（圖3I）。

圖3 吸入mRNA LNPs處方體內(nèi)篩選試驗

篩選出的最佳配方為：SP-A 抗體修飾的GAE14N，脂質(zhì)成分摩爾比：GAE14:膽固醇:DSPE-PEG2000-NHS:DOPE+DPPC =45:25:2.5:10（DOPE/DPPC=3/1）。隨后，同時封裝BMP4和CYB5R3 mRNA進行體內(nèi)外遞送效率、表達情況、治療效果及生物安全性的評估。

總之，研究團隊成功開發(fā)了一種可吸入的 LNP，顯示出深層肺滲透和胞質(zhì) mRNA 遞送，以介導(dǎo) AT2 細胞中高效的 CYB5R3 和 BMP4 翻譯。值得注意的是，LNP 通過抵抗 AT2 干細胞的耗竭以及成纖維細胞的異常激活來重塑肺結(jié)構(gòu)，從而有效地逆轉(zhuǎn)了 IPF。此項工作通過恢復(fù)上皮干細胞的功能來實現(xiàn)肺泡穩(wěn)態(tài)和修復(fù)，為解決IPF可逆治療中未滿足的需求提供了一種創(chuàng)新選擇。

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